जीवविज्ञानियों ने CRISPRoff प्रणाली विकसित की है, जो डीएनए में उत्परिवर्तन की शुरुआत किए बिना जीन गतिविधि के लक्षित दमन में सक्षम है। इस उपकरण का तंत्र एपिजेनेटिक रिप्रोग्रामिंग पर आधारित है, जो जीन में सीपीजी मिथाइलेशन साइटों से स्वतंत्र है। CRISPRoff जीन गतिविधि का दमन विरासत में मिला है, जिसे न्यूरॉन्स में विकसित होने वाली स्टेम कोशिकाओं की पीढ़ियों में दिखाया गया है। वैज्ञानिकों ने एक ऐसा उपकरण भी बनाया है जो CRISPRoff के बाद जीन गतिविधि को बहाल कर सकता है और इसे CRISPRon नाम दिया है। शोध जर्नल सेल में प्रकाशित हुआ है।
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प्रारंभ में, नोट को "डीएनए ब्रेक के बिना जीनोम संपादित सीआरआईएसपीआर-टूल" कहा जाता था, लेकिन इससे पहले "मृत" कैस 9 (मृत कैस 9) पर आधारित सिस्टम पहले से ही थे और एपिजेनोम में परिवर्तन करने में सक्षम थे। लेकिन इस तरह के कार्यों में, नोट में चर्चा के विपरीत, विभाजित कोशिकाओं की पीढ़ियों में परिवर्तन की विरासत की जाँच नहीं की गई थी, जो संशोधित शीर्षक में परिलक्षित होती है। CRISPR / Cas9 निर्देशित जीनोमिक संपादन प्रणाली जैविक अनुसंधान में सबसे अधिक मांग वाले उपकरणों में से एक है। इस तरह की प्रणाली एक गाइड आरएनए के साथ संयोजन में कैस 9 प्रोटीन का उपयोग करके जीनोम में एक विशिष्ट स्थान पर ब्रेक बनाना संभव बनाती है, जिसका उपयोग अक्सर दो उद्देश्यों के लिए किया जाता है: एक टूटे हुए जीन को "बंद करना" या एक नया अनुक्रम सम्मिलित करना। विराम। गैर-कार्यशील जीन वाले मॉडल प्राप्त करना वैज्ञानिकों के कार्यों के आधार पर उनके कार्यों का अध्ययन करना और जीवों के गुणों को बदलना संभव बनाता है। 2020 में CRISPR/Cas प्रणाली के संचालन के तंत्र की खोज के लिए, शोधकर्ताओं इमैनुएल चार्पेंटियर और जेनिफर डौडने को नोबेल पुरस्कार प्रदान किया गया।
इस पद्धति की बहुमुखी प्रतिभा के बावजूद, इसका अनुप्रयोग डीएनए अनुक्रम में ब्रेक बनाने की आवश्यकता से सीमित है, जो अक्सर जीनोम के गैर-लक्षित क्षेत्रों में उत्परिवर्तन और लक्षित लोगों में अनुचित डीएनए मरम्मत की ओर जाता है। उदाहरण के लिए, कुख्यात हे जियांगकुई, जिसे पहले आनुवंशिक रूप से संशोधित बच्चे (और बाद में जेल की अवधि) प्राप्त हुए थे, अपने प्रयोगों में CRISPR की सटीकता को नियंत्रित नहीं कर सके - जुड़वाँ जीनोम में अलक्षित उत्परिवर्तन थे।
कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय के जीवविज्ञानियों ने एक CRISPR तंत्र बनाया है जो डीएनए में बिना किसी रुकावट और उत्परिवर्तन के जीन को बंद कर सकता है। यह एपिजेनेटिक रिप्रोग्रामिंग पर आधारित है - न्यूक्लियोटाइड्स का मिथाइलेशन (उनसे एक मिथाइल समूह का जुड़ाव) इस तरह से कि जीन ट्रांसक्रिप्शनल एंजाइमों के लिए अपनी आत्मीयता खो देता है और काम करना बंद कर देता है। जीवविज्ञानियों ने उनके विकास को CRISPROF कहा।
जैसा कि शास्त्रीय CRISPR उपकरण में होता है, इसमें एक घटक Cas9 प्रोटीन है, लेकिन सामान्य नहीं, बल्कि "मृत" (डेडकैस) - अर्थात, यह केवल वांछित डीएनए क्षेत्र से बंध सकता है, लेकिन इसमें कोई विराम नहीं बना सकता है।. यह अन्य उत्प्रेरक डोमेन - मिथाइलट्रांसफेरेज़ से जुड़ गया था। इस प्रकार, काइमेरिक प्रोटीन जीन की गतिविधि को दबाते हुए, अपने चारों ओर डीएनए न्यूक्लियोटाइड को मिथाइलेट करने में सक्षम था। उसी समय, कोशिकाओं में प्रोटीन के जुड़ने के 10 दिन बाद ही, इसका पता नहीं चल पाया था, हालांकि इसका प्रभाव अध्ययन के 15 महीने तक बना रहा। प्रणाली की विशिष्टता और दक्षता की पुष्टि आरएनए अनुक्रमण द्वारा की गई थी - दबे हुए जीनों में व्यावहारिक रूप से कोई प्रतिलेख नहीं था। CRISPRoff प्रभाव उन जीनों के लिए भी देखा गया था जिनमें CpG द्वीपों को एनोटेट नहीं किया गया था - डीएनए में दो-न्यूक्लियोटाइड साइट जिस पर कोशिका में प्राकृतिक मिथाइलेशन होता है, अर्थात, यह संभवतः जीनोम में किसी भी अनुक्रम के लिए उपयोग किया जा सकता है।
जीवविज्ञानियों ने भी पुष्टि की है कि CRISPRoff मिथाइलेशन को उलटा किया जा सकता है। ऐसा करने के लिए, उन्होंने एक समान टूल बनाया - CRISPRon। इस प्रोटीन में निष्क्रिय कैस और एक एंजाइम भी शामिल था, लेकिन इस बार यह एक डीमेथिलेटिंग एजेंट था। इसके काम का परीक्षण करने के लिए, जीवविज्ञानियों ने उन कोशिकाओं का उपयोग किया जिनमें सीएलटीए जीन पहले से ही मिथाइलेटेड था।CRISPRon के आवेदन के दस दिनों के भीतर, कोशिकाओं में जीन का सामान्य स्तर बहाल हो गया था (p <0, 0001)।
अन्य प्रकार की कोशिकाओं में प्रेरित स्टेम कोशिकाओं (ISCs) के विभेदीकरण के दौरान CRISPRoff का प्रभाव कैसे बना रहता है, इसका परीक्षण करने के लिए, जीवविज्ञानियों ने प्रोटीन के साथ उनका इलाज किया और फिर उन्हें न्यूरॉन्स में पुन: प्रोग्राम किया। यह अनुसंधान के लिए तंत्रिका कोशिकाओं को प्राप्त करने के सबसे सामान्य तरीकों में से एक है, और भेदभाव के दौरान मिथाइलेशन की अवधारण उपकरण का उपयोग करने के लिए एक महत्वपूर्ण संपत्ति है। यह पता चला कि वैज्ञानिकों द्वारा चुने गए जीन पर न्यूरॉन्स ने वास्तव में मिथाइल लेबल बनाए रखा।
अन्य प्रणालियों को भी सीआरआईएसपीआर/कैस प्रौद्योगिकी के आधार पर विकसित किया जा रहा है। उदाहरण के लिए, हाल ही में फोटोइंडक्शन का उपयोग करके विधि की प्रभावशीलता में वृद्धि हुई थी, और एक उपकरण भी बनाया गया था जो एक ही समय में कई जीनों को संपादित करने और उनमें से क्षेत्रों को काटने में सक्षम है।
